Perguntas e Respostas sobre HPLC - Parte 3

Artigos Welch / Chromastore   artigo 11FEV22 Traduzido por Ronaldo Buissa Netto

 

Perguntas e Respostas sobre Cromatografia Líquida

Esta é a parte 3 da série de perguntas e respostas sobre Cromatografia Líquida que foi publicada anteriormente. Esta parte abordará mais perguntas e respostas, que o ajudarão a saber mais sobre cromatografia líquida.

 

1

P: Qual solvente é adequado para armazenar colunas de sílica gel utilizadas em cromatografia de fase normal ?

 

R: Não importa se o período de armazenamento é curto ou longo, indicamos o uso de uma fase móvel geralmente composta por n-hexano e uma pequena  quantidade de isopropanol (95:5 /  99:1 /  99,5:0,5).

 

2

P: Por que os tamponamentos com fosfatos diminuem a vida útil da coluna cromatográfica ? Comparado com outros tampões, quanto o uso do tampão fosfato reduz a vida útil da coluna ?

 

R: Em primeiro lugar, precisamos corrigir um mal-entendido. Para colunas cromatográficas, um pH > 6,5 não é um “ambiente neutro” como todos entendem. Quando o pH do sal tampão é superior a 6,5, é um ambiente alcalino para a coluna cromatográfica, por isso é prejudicial à matriz de sílica. Além disso, a molécula de fosfato é pequena, o que facilita sua entrada na fase ligada, resultando na hidrólise destas ligações entre base estruturante de sílica e a fase ligada. Devido às vantagens insubstituíveis do tampão de fosfato, como propriedade estáveis, excelente capacidade de tamponamento, entre outras, este é um dos sais mais utilizados no cromatografia líquida, o que obriga os usuários a aceitarem que uma coluna cromatográfica terá sua vida útil diminuída devido ao uso rotineiro deste sal.

 

3

P: Como os reagentes de pareamento iônico funcionam na cromatografia de fase reversa por pareamento iônico ?

 

R: Em primeiro lugar, a extremidade polar do reagente de pareamento iônico se associa ao íon alvo formando um complexo para reduzir sua polaridade, para que possa ser melhor retido na coluna cromatográfica. Além disso, de acordo com a teoria do efeito hidrofóbico, a extremidade hidrofóbica do reagente de pareamento iônico interage facilmente com a cadeia C18 (ou outro grupo apolar presente na superfície da sílica), por isso é mais fácil conseguir retenção na coluna. Portanto, a ação do reagente de pareamento iônico é um mecanismo de retenção misto, ou seja, a atuação do pareador iônico na formação do complexo entre analito e pareador e a sua atuação “mascarando” os grupos polares presentes no analito. Essas duas ações ocorrem juntas.

 

4

P: Qual é a diferença entre o reagente do pareamento iônico tetrabutilamônio e o alquil sulfonato de sódio ? Por que o tetrabutilamônio tem uma influência tão grande na vida útil da coluna cromatográfica ?

 

R: O tetrabutilamônio como pareador iônico não é tão utilizados quanto os reagentes de pareamento iônico de alquil sulfonato de sódio. A razão é que as substâncias polares ácidas podem facilmente melhorar a capacidade de retenção na cromatografia de fase reversa, reduzindo o valor do pH. A redução do pH pode inibir a ionização do ácido, tornar o ácido em estado neutro e aumentar a interação com a cadeia de carbono hidrofóbica. Os analitos alcalinos são seriamente afetados pelo limite superior do pH da matriz de sílica, e é difícil ajustar o pH da fase móvel para muito alto. Portanto, reagentes de pareamento de cátions são frequentemente adicionados em pH baixo ao analisar compostos alcalinos. Experimentos mostram que os reagentes de pareamento iônico  tetrabutilamônio são mais difíceis de remover da superfície de empacotamento da coluna do que o pareador alquil sulfonato de sódio e outros reagentes de pareamento de cátions, por isso a desgaste intenso e prematuro da vida útil da coluna cromatográfica.

 

5

P: Por que o tempo de retenção muda para a mesma coluna cromatográfica, depois de terminar o Projeto A e depois o Projeto B ? Por que a forma do pico é anormal ? O que vai acontecer ?

 

R: A coluna cromatográfica está contaminada por substâncias de forte retenção, ou seja, após a interação do contaminante com o leito empacotado, o tempo de retenção é adiantado ou atrasado. A identificação do problema depende da natureza do contaminante e da ação conjunta do analito, fase estacionária e contaminante na superfície da coluna, e quanto mais complexa essa interação, mais difícil prever os resultados experimentais futuros. Durante a manutenção de rotina, preste atenção à retrolavagem e a limpeza dos contaminantes com solvente que possa dissolvê-los após a sua análise, de modo a reduzir ou evitar esta situação.

 

6

P: Qual é o objetivo da derivatização pré-coluna por HPLC?

 

R: O método de derivatização química na tecnologia cromatográfica refere-se ao método de separação e detecção após a mudança dos componentes da amostra em derivados correspondentes com reagentes químicos especiais (geralmente referidos como reagentes de derivatização) no processo cromatográfico. O objetivo é: 1. Melhorar a sensibilidade de detecção através da introdução de grupos funcionais de forte absorção no ultravioleta-visível no analito a ser detectado ou adicionando grupos fluorescentes para convertê-los em derivados fluorescentes; 2. Melhorar a separação e seletividade de amostras analíticas.

 

7

P: Quando tenho vários analitos difíceis de separar, como melhorar a separação selecionando a coluna apropriada ?

 

R: Três fatores principais influênciam na separação: eficiência da coluna, seletividade e fator de retenção. A eficiência da coluna pode ser melhorada reduzindo o tamanho de partícula do leito empacotado e aumentando o comprimento da coluna; a seletividade está relacionada com a seleção da fase estacionária e condições de pH. A seletividade pode ser melhorada selecionando a coluna cromatográfica apropriada e pH apropriado; O fator de retenção está relacionado principalmente à composição e proporção da fase móvel; além disso o pH e a força iônica da fase móvel afetam o estado existente do analito de interesse e também afetam o fator de retenção. Às vezes, aumentar o fator de retenção também pode melhorar a separação.

 

8

P: Quando devo considerar o uso de colunas Fenil e colunas Ciano?

 

R: As colunas Fenil tem alta seletividade para a determinação de compostos aromáticos contendo anel benzênico. As colunas CN pode ser usadas como uma coluna de fase reversa com a capacidade de retenção mais fraca ou uma coluna de fase normal com atividade reduzida.

 

9

P: Tenho o mesmo tipo de coluna em diferentes comprimentos e tamanhos de partículas. Como escolher entre elas ?

 

R: O comprimento e o tamanho da partícula são usados para alterar a eficiência da coluna (quanto mais comprida a coluna, mais eficiente; quanto menos o tamanho de partícula, mais eficiente). Quando o número de substâncias a serem separadas é ≤ 5, a coluna cromatográfica com comprimento de coluna de 150 mm pode atender a separação da maioria das amostras.

 

10

P: Uma coluna C18 comum pode ser usada como coluna cromatográfica de fase normal ? Que tipo de coluna cromatográfica é a mais comum e a mais usada na cromatografia de fase normal? O que deve ser observado no uso da coluna de fase normal em comparação com a coluna de fase reversa?

 

R: O modo de separação da cromatografia de fase normal significa que a polaridade da fase estacionária é maior que a da fase móvel. Na cromatografia de fase reversa, a polaridade da fase móvel é maior que da fase estacionária. A fase estacionária C18 é relativamente hidrofóbica. Hidrofobicidade forte significa que a polaridade é muito fraca. Não deve haver fase móvel com polaridade mais fraca do que ela. Além disso, ao usar a coluna cromatográfica, deve-se notar que a fase estacionária polar deve evitar o solvente polar tanto quanto possível, e a fase estacionária não polar deve evitar o solvente não polar o máximo possível, caso contrário, o efeito da “miscibilidade semelhante” pode ocorrer (eluição demorada / longos tempos de retenção).

As colunas de fase normal mais comuns incluem as colunas de sílica, coluna amino, coluna CN e coluna à base Diol. A coluna mais comum deve ser a coluna de sílica gel. A coisa mais importante a se prestar atenção quando utilizando uma coluna de fase normal é com relação a água. A coluna de fase normal é muito sensível à umidade / água. A pequena alteração do teor de umidade / água na fase móvel tem grande influência no tempo de retenção. Portanto, o tempo de equilíbrio de uma coluna de fase normal pode variar de algumas horas ou até mais.