Perguntas e Respostas sobre HPLC - Parte 4

Esta é a parte 4 da série de perguntas e respostas sobre Cromatografia Líquida que foi publicada anteriormente. Esta parte abordará mais perguntas e respostas, que o ajudarão a saber mais sobre cromatografia líquida.

1

P: Como podemos evitar cauda no meu pico ?

 

R: Antes de tudo, precisamos descobrir a causa da formação de cauda, que geralmente é causado pelos seguintes motivos: efeitos extra coluna, leito empacotado contaminado e interação entre analito e sítio ativo na fase ligada, e cada um dos motivos precisa ser tratado separadamente.

 

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P: Como identificar a causa da cauda no meu pico ?

 

R: O cromatograma pode fornecer muitas pistas para identificarmos o problema. A natureza da amostra e as condições analíticas também nos dão informações indispensáveis para isolar este tipo de problema. A sobrecarga de massa é um dos possíveis problemas da formação de cauda; a injeção da amostra diluída 1:10 indicará se o formato de pico poderá ser melhorado somente com esta mudança de concentração. Se a cauda persistir mesmo em baixas concentrações, observe o cromatograma. Se houver muitos picos no cromatograma, veja se cada padrão de pico mantém um certo grau de cauda ou tem uma tendência consistente ao longo do tempo. Se os picos que eluem mais cedo apresentam mais cauda que os picos mais retidos, considere os efeitos extra coluna (tubos muito compridos, diâmetros internos incorretos e conexões mal formatadas são os principais problemas). Se todos os picos no cromatograma tiverem o mesmo grau de cauda, existem duas possibilidades: 1) danos no leito empacotado, 2) todas as amostras no cromatograma têm estrutura química semelhante e a cauda é causada por um efeito químico.

 

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P: Quais substâncias produzem esses efeitos químicos, você pode explicar? Como lidar com isso ?

 

R: Existem vários efeitos químicos, sendo o mais comum a interação de analitos com sítios ativos no leito cromatográfico. A cauda de compostos básicos na coluna de fase reversa é bem comum. Normalmente, compostos com grupos polares ou básicos como – COOH, – NH2, – NHR, – NR2 podem ter adsorção secundária entre hidroxilas e silanóis residuais na superfície do leito empacotado, resultando em cauda.

 

Soluções:

1) Para a análise de compostos básicos, a trietilamina (TEA) pode ser adicionada à fase móvel como agente redutor de cauda. O TEA compete com o composto básico para ligar o grupo hidroxila ao silanol residual, minimizando assim as interações entre o analito e a superfície do leito cromatográfico.

 

2) A cauda de compostos ácidos requer a redução do valor de pH da fase móvel para protonar o ácido o máximo possível. Ácidos orgânicos competitivos podem ser adicionados à fase móvel, como o ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%, que tem um melhor resultado pois tem UV cut-off baixo (comprimento de onda limite onde aquele aditivo começa a apresentar leitura na região do UV).

 

3) Aumentar a concentração de sais tampão na fase móvel para inibir a ação iônica.

 

4) Adicione reagente de pareamento iônico à fase móvel, concentração 0,003-0,01 mol/L, para otimizar o formato de pico e aumentar a retenção do composto.

 

5) Escolha colunas de sílica de alta pureza e capeadas, como: Welch Ultisil® Polar-RP, Xtimate® C18, etc.

 

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P: Em alguns cromatogramas, podemos ver o pico cromatográfico com cauda frontal. O que causa a cauda frontal em um pico ?

 

R: Em primeiro lugar, também precisamos encontrar as razões para a cauda frontal de um pico. A cauda frontal de um pico geralmente tem os seguintes motivos: volumes extra coluna, leito empacotado contaminado e efeito do solvente. Isso exige que encontremos a causa e resolvamos o problema observando o cromatograma. Claro que, no caso de sobrecarga de amostra, também verificamos reduzindo a concentração da amostra. Se mesmo em baixas concentrações ainda verificamos a cauda frontal, observe o cromatograma. Se houver muitos picos no cromatograma, veja se cada tipo de pico mantém um certo grau de cauda frontal ou se tem uma tendência de mudança consistente com o tempo, ou seja, picos eluidos mais cedo apresentam mais ou menos cauda frontal que picos eluidos tardiamente. Se a cauda frontal é mais intensa que a cauda traseira do pico no cromatograma, devemos considerar tanto os efeitos extra coluna como também efeitos de solvente. Se o formato da cauda frontal for semelhante a todos os picos no cromatograma, isso pode ser causado por leito empacotado danificado ou pelas propriedades químicas das substâncias da amostra a ser separada.

 

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P: Como você resolve a cauda frontal em um pico?

R:

1) Para cauda frontal de pico causada pelo efeito do solvente, em cromatografia de fase reversa, se for usado solvente 100% orgânico ou 100% modificador de fase forte, o pico cromatográfico será lavado da coluna cromatográfica prematuramente durante a injeção de grande volume, resultando em deformação do pico, que pode ser evitada fazendo injeções de volumes menores com a utilização de fase móvel como diluente, ou diluente com composição química (polaridade) mais próxima da fase móvel. Se um modificador de fase forte precisa ser utilizado como diluente, é necessário reduzir o volume de injeção.

2) Se a cauda frontal é causada por efeitos extra coluna, precisamos reduzir o volume morto do sistema cromatográfico e, em seguida, resolver o fenômeno da cauda frontal.

3) Para cauda frontal causada pela natureza da amostra, pode-se considerar aumentar a concentração de sal tampão na fase móvel, aumentar a força iônica na fase móvel, ou adicionar uma quantidade adequada de tetrahidrofurano (THF) na fase móvel (geralmente 5%). Aumentar a temperatura da coluna também é uma boa alternativa.

4) Volume morto na cabeça da coluna - o espaço gerado pelo dano causado ao empacotamento cromatográfico na cabeça da coluna faz com que a vazão da fase móvel e do soluto se movam mais rápido do que a vazão média, resultando em cauda ou extensão de pico.

5) Coeluição – duas substâncias quimicamente parecidas não estão separadas, mas aparenta ser uma cauda frontal.

 

Análise de caso de cauda frontal de pico: coluna C18, a fase móvel água-metanol (55:45), a substância de referência e os picos de amostra são todos encaminhados?

 

1) Sobrecarga de amostra. Reduza a concentração de injeção para ver se a forma do pico é melhorada. Geralmente considera-se que a altura do pico é de cerca de 100 mAU, o que não afetará a forma do pico devido à sobrecarga.

2) Verifique se a amostra está dissolvida em fase móvel. A capacidade de eluição do solvente (como metanol puro) dissolvendo a amostra é mais forte do que a da fase móvel, e o pico será atrasado. Quando uma amostra é diluída pela fase móvel, ela apresenta deslocamento uniforme durante todo o seu percurso de interações com o leito cromatográfico empacotado, pois fase móvel e amostra apresenta química semelhante. O uso de modificador de fase forte como diluente altera a maneira que a amostra avança na coluna, alterando a velocidade de eluição, causando interações não esperadas e efeitos no formato de pico.

3) Aumente a concentração de sal tampão na fase móvel. Aumentar a concentração de sal tampão pode aumentar a força iônica na fase móvel e reduzir o atraso no deslocamento causado pela ação eletrostática (que pode existir entre as moléculas da amostra ou entre as moléculas da amostra e a superfície do empacotamento).

4) Adicione uma quantidade apropriada de tetrahidrofurano na fase móvel. A adição de uma pequena quantidade de tetrahidrofurano à fase móvel pode algumas vezes melhorar a forma do pico e aumentar a resolução. Muitos cromatografistas conhecem o recurso e o utilizam, mas seu mecanismo parece raramente ser mencionado. Normalmente, a quantidade adicionada é inferior a 5%, e uma quantidade maior pode ser adicionada quando necessário.

 

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P: Como a coluna HPLC deve ser ativada ?

R: Verifique sempre o manual de cuidados de sua coluna antes de seguir qualquer procedimento. Para colunas de cromatografia líquida, cada coluna é testada antes do envio e armazenada no eluente de teste para transporte. Portanto, no primeiro uso, recomenda-se ativar com uma fase móvel 80:20 (MeOH:H2O), com fluxo moderado (normalmente metade do fluxo do método a ser utilizado), por aproximadamente 4 horas; em seguida a coluna cromatográfica pode ser completamente equilibrada com a fase móvel. Se forem usados aditivos de fase móvel (como tampão ou reagente de pareamento iônico), recomenda-se usar a fase móvel com a proporção original, mas sem esses aditivos para transição intermediária, e então substituí-la pela fase móvel da amostra analítica após 10 – 20 volumes de coluna. Para colunas com fases ligadas de cadeia química curta (por exemplo, C8, fenil, CN), deve-se tomar cuidado para garantir que elas estejam completamente equilibradas antes de usar a coluna. Isso garante a repetibilidade e ajuda a evitar desvios no tempo de retenção.

O solvente de fase normal e o solvente de fase reversa são imiscíveis, o que não pode ser ignorado. Para uma coluna recém-adquirida, abra primeiro o manual de cuidados da coluna e seu certificado de análise e teste para verificar o solvente de armazenamento da coluna. Se o solvente de armazenamento for imiscível com a fase móvel que você usará, faça a transição com isopropanol primeiro. Durante o processo de transição, preste atenção ao aumento da pressão da coluna devido à alta viscosidade do isopropanol e reduza adequadamente o fluxo. Se a fase móvel contém sais tampão, primeiro use a fase móvel com a mesma proporção sem sais tampão para evitar a precipitação de sais tampão.

 

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P: Quando uso a coluna amino para analisar açúcares, por que o tempo de retenção do analito de interesse é instável e avança gradualmente ?

 

R: Isso é causado pelas características da coluna amino. Ao analisar açúcares, a fase móvel típica da coluna amino é de 60% ~ 90% de mistura de água:acetonitrila. Durante o uso, a alta concentração de grupos amino (pH básico) nas lacunas do leito empacotado resultam na hidrólise lenta da sílica e da fase ligada. Com o passar do tempo, o leito se torna mais ineficiente, o que levará à mudança do tempo de retenção do analito de interesse. Ao mesmo tempo, isso explica o porquê a vida útil de uma coluna Amino diminui em condições de fase reversa.

 

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P: Alta pressão de coluna ?

 

R: O aumento de pressão da coluna cromatográfica é um problema comum na rotina dos analistas de cromatografia líquida, e um entupimento é um dos primeiros suspeitos. As principais razões para o aumento da pressão são resumidas da seguinte forma:

- O frit na entrada da coluna cromatográfica está parcialmente entupido;

- A amostra ou sal tampão da fase móvel precipita na coluna cromatográfica;

- Contaminação da coluna cromatográfica;

- A viscosidade da fase móvel é muito alta;

- O filtro em linha ou a coluna de guarda está entupida;

- Entupimento de tubulação;

- Coluna polimérica: inchaço causado pela mudança de solvente.

 

Soluções:

1- Lave a coluna cromatográfica por retrolavagem (backflush) com um ~ 1/4 do fluxo de trabalho sem conectar o detector para remover o entupimento do frit (exceto para coluna cromatográfica de partículas de 1,8μm – colunas UHPLC).

2- Tente usar a fase móvel como solvente da amostra para reduzir a possibilidade de precipitação da amostra. Reduza ao máximo a concentração de sal na fase móvel. Após o uso da fase móvel com sal, a coluna deve ser lavada com 10 a 20 volumes de coluna de água ultrapura e fase orgânica na mesma proporção do sal na fase móvel, e então armazenada em solvente adequado.

3- A coluna cromatográfica está contaminada e precisa ser limpa e regenerada.

4- Tente escolher um solvente de baixa viscosidade como fase móvel ou aumente a temperatura da coluna.

5- Verifique o frit do filtro em linha e o cartucho da coluna de guarda e substitua-os necessário.

6- Desmonte a tubulação para verificação se a pressão cai e substitua se necessário.

7- Para colunas à base de polímeros, são necessárias informações sobre a compatibilidade do solvente.

 

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P: Pressão baixa na coluna ?

R: Quando a pressão da coluna cromatográfica diminui, um “vazamento” deve ser considerado primeiro. As principais razões para o aparecimento de baixa pressão são resumidas a seguir:

 

1- O elemento filtrante de entrada de solvente está bloqueado (filtro de garrafa do solvente);

2- Vazamento no sistema pressurizado (parafusos, anilhas, tubulações, selos de bomba, válvulas de injeção, assentos de agulham entre outros componentes);

3- Mudança de solvente ou fluxo;

4- A válvula de entrada da bomba falha (check valve de entrada);

5- A válvula de saída da bomba falha (check valve de saída);

6- Leito empacotado da coluna cromatográfica danificado e perda de fase estacionária.

Solução:

1- Verifique todas as tubulações, conectores e componentes do sistema fluídico pressurizado;

2- Substitua a coluna cromatográfica;

3- Verifique se as condições cromatográficas mudaram;

4- Verifique se o fluxo da bomba é preciso.

 

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P: O que é volume morto e volume de atraso da fase líquida ?

 

R:

1) Volume morto

Refere-se ao volume entre o ponto de injeção efetivo ao ponto de detecção efetivo que exclui a porção da coluna que contém a fase estacionária. Consiste em 4 partes: o volume do tubo do injetor à coluna cromatográfica, o espaço entre as partículas da fase estacionária na coluna (ocupada pela fase móvel, Vm), o volume do tubo de saída da coluna e o volume da célula de fluxo do detector. Entre eles, apenas Vm participa do processo de equilíbrio cromatográfico, e as outras três partes apenas desempenham um papel no alargamento do pico. Para minimizar este problema de alargamento do pico, o volume dessas três partes deve ser minimizado ao máximo.

 

2) Volume de atraso

O volume de atraso refere-se ao volume entre o ponto de mistura do solvente (geralmente na câmara de mistura / mixer ou válvula proporcionadora de gradiente / GPV / MCGV de um cromatógrafo líquido) e a cabeça da coluna cromatográfica.