11/01/2022

Perguntas e respostas sobre Cromatografia Líquida - parte 1

1

 

P: Quais são as vantagens da Cromatografia Líquida (LC) sobre a Cromatografia Gasosa (GC) ?

 

R:  A Cromatografia Líquida apresenta algumas vantagens com relação a Cromatografia Gasosa, pois tem uma faixa de aplicação muito mais ampla. A Cromatografia Gasosa, de maneira geral, se limita apenas a analisar substâncias de baixo peso molecular que são facilmente vaporizadas e visa principalmente as matérias-primas químicas fundamentais. Mas qualquer substância solúvel em solvente, variando de dezenas a centenas de milhares de unidades de peso molecular, podem ser analisadas por Cromatografia Líquida. Em produtos farmacêuticos, químicos, proteção ambiental, alimentos e muitos outros campos importantes, a Cromatografia Líquida se tornou uma ferramenta analítica líder. Existem também algumas circunstâncias em que ambas as técnicas podem ser aplicadas, mas a preparação da amostra para LC é mais simples. O surgimento da Cromatografia Líquida compensou falhas da técnica de GC a A aparência do LC compensa o defeito de que o GC, como não poder ser usado diretamente para analisar compostos voláteis ou na análise de compostos termolábeis e polímeros.

 

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P: Os analistas de laboratório costumam duvidar se a coluna cromatográfica de LC pode ser limpa utilizando a técnica de retrolavagem ( em Inglês, backflush -quando a limpeza da coluna e feita invertendo o sentido do fluxo). Que tipo de coluna pode ser limpa utilizando esta técnica ? E qual coluna não pode? Após a retrolavagem, a coluna deve ser usada na direção normal?

 

R: Geralmente, as colunas de fase normal e de fase reversa podem ser limpas por retrolavagem. Mas a retrolavagem não pode ser usada em colunas que apresentam frita de entrada e saída com tamanho de poro assimétrico, colunas fabricadas desta maneira são incomuns nos dias atuais. A retrolavagem visa retirar os contaminantes da coluna de maneria fácil e rápida, por isso é melhor usar a coluna na direção normal para evitar contaminação em ambas as extremidades. A maioria das colunas Welch podem ser limpas por retrolavagem, e recomendamos o uso de colunas na direção normal e a limpeza na direção oposta.

 

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P: Alguns fabricantes usam um tamanho de poro maior (2 ~ 5 μm) na frita de entrada para evitar o entupimento, com isso a retrolavagem irá remover material do leito empacotado. O tamanho dos poros das fritas de entrada e saída serão informados nas instruções de uso da coluna ?

 

R: Se o tamanho dos poros das fritas de entrada e saída da coluna forem assimétricos, o fabricante certamente o mencionará nas instruções. O tamanho dos poros das fritas de entrada e saída das colunas Welch é simétrico.

 

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P: A coluna deve ser conectada ao detector durante o retrolavagem?

 

R: O retrolavagem significa conectar a coluna ao sistema na direção oposta. Teoricamente, a coluna pode estar conectada ou desconectada do detector. No entanto, durante a retrolavagem, todo o material particulado retido pela frita da coluna irá se movimentar no caminho fluídico e caso o detector esteja conectado, corre-se o risco aumentado de entupimento de partes sensíveis do detector. Por esta razão, é recomendado não conectar o detector durante a retrolavagem e colocar a tubulação de saída da coluna diretamente no seu descarte de solventes.

 

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P: Ao usar a coluna de troca iônica para fazer o desenvolvimento analítico de uma metodologia, e acetonitrila (ACN) e água como fase móvel, verificou-se que RT (tempo de retenção) é de 2,5 minutos com 60% de ACN e o RT permanece o mesmo com 30% ou 40% de ACN; mas o RT repentinamente muda para cerca de 13 minutos com 20% de ACN durante o processo de ajuste do gradiente. Qual é o motivo?

 

R: O mecanismo de retenção das colunas de troca iônica é principalmente a interação eletrostática. Os principais fatores de influência incluem força iônica, pH, interação secundária de ligações de hidrogênio e exclusão molecular. Portanto, na cromatografia de troca iônica, o mecanismo de retenção não é tão simples quanto a cromatografia de fase reversa, nem sua atuação é clara somente alterando a proporção da fase orgânica. É necessário considerar se o aumento da proporção de fase aquosa leva à mudança da força iônica da fase móvel ou aumenta as interações das pontes de hidrogênio. Além disso, se a matriz da coluna de troca iônica é sílica gel ou polimérica, temos também tem efeitos diferentes.

 

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P: Para uma coluna C18 usada em minha rotina, como ativar e manter esta nova coluna? Por que eu deveria ativar uma coluna nova ?

 

R: A ativação da nova coluna é na verdade um processo de equilíbrio. Durante o transporte e armazenamento da coluna, o solvente na coluna pode volatilizar, resultando em um leito empacotado seco. Como a fase ligada não está totalmente “molhada”, a coluna precisa ser ativada. As colunas Welch podem ser ativadas de acordo com as instruções. Além de equilibrar com a fase móvel, às vezes é necessário equilibrar a nova coluna com as amostras testadas. O método de equilíbrio específico também é muito simples, basta aumentar a concentração da amostra injetada ou fazer múltiplas injeções enquanto a eluição não estiver completa. O objetivo de equilibrar uma nova coluna é saturar a capacidade de adsorção dos sítios ativos presentes na superfície do leito empacotado de sílica com adsorção não específica.

 

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P: A coluna C18 será ativada com metanol utilizando fluxos baixos. Qual é o propósito disso?

 

R: A coluna C18 será ativada com metanol utilizando fluxos baixos, pois a solução de armazenamento pode volatilizar no processo de armazenamento e transporte. A baixa taxa de fluxo de metanol pode infiltrar-se bem na fase estacionária, fazendo com que a fase ligada se estique bem. Depois de equilibrar o sistema com solvente, o cromatograma pode ser obtido mais rapidamente por múltiplas injeções ou aumentando o volume da injeção. Desta forma, os sítios ativos na coluna podem saturar com amostras para evitar fenômenos anormais.

 

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P: Eu tinha acabado de instalar uma nova coluna C18 outro dia e lavei com metanol 100% por mais de meia hora antes da injeção. Se eu só lavar meia hora e começar a usar, tudo bem? Isso afetará o pico?

 

R: Em primeiro lugar, se for apenas a ativação de uma nova coluna, recomenda-se seguir rigorosamente as instruções do fabricante; em segundo lugar, nem todas as determinações requerem saturação da coluna nova. No entanto, é um bom hábito injetar várias vezes de acordo com o método e iniciar a determinação formal após garantir que o tempo de retenção do pico de interesse esteja estável.

 

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P: Quais colunas são geralmente usadas para a determinação de peptídeos? Se a fase móvel inclui acetonitrila, água e um pouco de TFA (ácido trifluoracético), ou preciso analisar peptídeos de cadeias curtas, que coluna devo escolher?

 

R: Os polipeptídeos com baixo peso molecular podem geralmente ser determinados por colunas convencionais C18 ou C8, bem como colunas de troca iônica e colunas hidrofílicas HILIC. Se a fase móvel contiver aditivos ácidos, como ácido trifluoroacético, é recomendável usar colunas que resistem a pH baixo, como as colunas da série Ultisil® LP.

 

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P: Quando a coluna amino (NH2) entra em contato com amostras acidificadas, isso pode danificar a coluna. Se a forma do pico mudar depois de usar a coluna por um curto período de tempo, o que devo fazer para manter a coluna?

 

R: Se você usar uma coluna amino (NH2) para determinar amostras acidificadas, o modo HILIC da coluna amino pode ser usado. Os ácidos podem protonar grupos funcionais amino ligeiramente carregados negativamente, resultando em alterações nas propriedades de retenção de alguns analitos ou diminuição da eficiência da coluna após o uso da coluna por um curto período de tempo. Sugestão: enxágue a coluna com 5 ~ 10 vezes o volume da coluna contendo 0,5 ~ 1,0% de NH3 numa solução acetonitrila / água (50/50, depois disso, lave o excesso de amônia com fase móvel livre de álcali). Um pouco de amônia, como 0,05%, é recomendado para ser adicionado na fase móvel ao analisar este tipo de analitos acidificados.